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江南官方网站:《食品科学》：四川农业大学刘书亮教授等：丝状真菌降

　　除虫菊酯（PYRs）类农药由于其杀虫谱广、药效高、对非靶标生物毒性低，被广泛应用于农业、林业和公共领域的蚊虫和害虫防治。PYRs具有光、热稳定性，在自然条件下很难快速降解，其残留引起的环境污染和食品安全问题较为严重。研究表明，PYRs可经消化道、呼吸道和皮肤黏膜进入机体，对微生物、水生动物和无脊椎动物产生高度急性毒性，包括神经毒性、免疫毒性和生殖毒性，此外，PYRs的降解中间产物3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）比母体农药更难降解，毒性更强。

　　丝状真菌因其具有丰富的氧化酶系，对多种芳香族类化合物、杀虫剂、染料等异生化合物具有较强的降解能力，在生物修复中具有独特的优势。四川农业大学食品学院的周巧，张梦梅，刘书亮*等人总结了降解PYRs和3-PBA的丝状真菌、降解途径及降解酶，详述了降解酶基因的筛选与验证方法，这不仅可为丝状线-PBA的降解途径和降解机制的研究提供理论依据，也可为环境及农产品的生物修复提供应用参考。

　　表1列出了PYRs和3-PBA结构、种类和特点。PYRs是一种人工合成的化合物，其化学结构和生物活性与天然的除虫菊酯类似，难溶于水，自然条件下不易分解。根据其化学结构和毒性，可将PYRs分I型和II型，I型缺乏氰基，主要包括丙烯菊酯和联苯菊酯等；II型具有α-氰基，主要包括氯氰菊酯和溴氰菊酯等，比I型更具有神经毒性。

　　3-PBA是PYRs的主要代谢产物之一，纯品为白色或淡结晶状粉末，熔点147～149 ℃，难溶于水，易溶于有机溶剂，CAS登录号为3739-38-6，分子式为C13H10O3，相对分子质量为214.22。与PYRs相比，3-PBA结构更稳定，在自然条件下更难降解，极性更强，在土壤中的迁移速率也比PYRs快。根据土壤类型、气候和其他条件，3-PBA在土壤中的半衰期一般为180 d，远超过PYRs。

　　PYRs由于低毒、高效被广泛使用，其残留问题也较严重，在土壤、空气、水体及农产品中都有残留的PYRs检出，其中在蔬菜、水果、茶叶等农产品中残留检出量为0.95～4 100.00 ng/g，且氯氰菊酯的检出率最高。随着PYRs的广泛使用，其主要代谢产物3-PBA在土壤、农产品、人类尿液及母乳的检出率也越来越高，是人类尿液中检出率最高的异生物质。

　　PYRs残留期虽短，但长期低剂量接触PYRs可导致慢性疾病。研究表明，PYRs具有影响离子通道、改变兴奋性神经递质水平、诱导神经细胞凋亡和扰动氧化应激水平等毒性作用，对脑组织产生严重损伤，并对生物体的神经、免疫、心血管和遗传系统产生毒性作用。此外，PYRs还可影响成年女性卵巢功能、降低男性精子的质量、影响青少年听力水平和学龄儿童认知水平，孕早期暴露于PYRs中还可能影响2岁儿童的神经发育等。而PYRs代谢产物3-PBA是一种抗雌激素类物质，具有内分泌干扰活性，也是一种多巴胺神经毒素，可能导致生物体帕金森病。同时3-PBA具有一定抗微生物活性，如果不能被及时降解，会抑制微生物的代谢活性，进一步阻碍母体农药的矿化降解，从而阻断该类农药彻底转化为无毒小分子物质，间接地使环境、农产品或食品中农药残留问题更加严峻。

　　丝状真菌一般指霉菌，是一种呈丝状、无光合作用的广泛分布于土壤、水域、空气及动植物体内外等自然环境中的真核微生物，包括子囊菌门、接合菌门和担子菌门。20世纪80年代中期，Science首次报道了可降解农药的白腐真菌，随后又发现了降解农药的新种曲霉属，直至近几年丝状真菌降解农药的研究才陆续被报道。

　　丝状真菌相较于其他微生物降解农药有以下几方面的优势：1）生物量更大而且遗传特性更加稳定，含有更多蛋白质编码基因；2）它可在任何基质和恶劣的环境条件下生长，存在于北极、深海、动物及其遗骸、海藻、红树林和土壤中；3）含有包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶在内的纤维素分解酶、木质素分解酶和漆酶（Lac）等胞外酶和细胞色素P450（CYP450）等胞内酶组成的独特氧化酶系统，可降解二苯醚类、芳香族类、氯酚类、杀虫剂及染料等物质。因此，丝状真菌是农药降解的优势物种，并且许多丝状真菌被归类为公认安全的（GRAS）微生物，在消减农产品及食品中农药残留方面有较好的应用前景。

　　丝状真菌降解农药可通过不同机制来完成，主要是矿化作用和共代谢作用。矿化作用是微生物以农药为唯一碳源和能源，使其彻底降解为水和二氧化碳；共代谢作用是微生物从其他底物获取大部分或全部碳源和能源后将同一介质中的农药进行降解，通常对农药的降解不彻底，会产生并积累毒性化合物，共代谢作用可降解顽固化合物如氯化烯烃、多环芳烃、多氯联苯、杀虫剂和药物等，以该方式进行降解的微生物广泛存在于自然界中。

　　具有降解PYRs和3-PBA的微生物广泛存在于自然界中，目前已筛选到大量可降解PYRs和3-PBA的丝状线-PBA具有降解能力的丝状线可知，降解PYRs的丝状真菌主要包括白腐真菌、曲霉属、散囊属、青霉属、地霉属、顶孢霉属、枝孢属、镰刀菌属等，其主要来源于土壤、农药厂污泥，其中枝孢菌（Cladosporium sp.）HU、曲霉菌（Aspergillus sp.）PYR-P2、镰刀菌（Fusarium sp.）TS-203及毛链孢菌（Monilochaetes sp.）TS-205对100 mg/L的PYRs降解率大于90%。降解3-PBA的丝状真菌相对较少，主要有曲霉属、散囊属、青霉属、根霉属等，其来源主要有黑茶、砖茶、酱醅及农药厂污泥，其中黑曲霉（Aspergillus niger）YAT1、冠突散囊菌（Eurotium cristatum）ET1、米曲霉（Aspergillus oryzae）M4不仅对100 mg/L的3-PBA有较高的降解率，达到99%以上，并且它们还可以降解PYRs。

　　单一微生物往往不具备矿化降解所需的酶系，加上母体农药产生的毒性代谢中间产物可能抑制微生物的生长，导致农药不能完全降解，因此筛选能够同时降解PYRs和3-PBA的菌株或者通过微生物共培养的方式来完成对PYRs和3-PBA的完全降解尤为重要。

　　目前，微生物降解3-PBA途径已有研究，其中细菌对PYRs的降解大多是在羧酸酯酶、脂肪酶或者氨肽酶的作用下，使PYRs酯键断裂生成3-PBA，然后3-PBA在苯氧基苯甲酸双加氧酶的作用下，断裂二苯醚键生成苯酚和原儿茶酸，生成的苯酚和原儿茶酸进入三羧酸循环最终生成水和二氧化碳。丝状真菌降解PYRs途径如图1所示（以氯氰菊酯为例），与细菌类似，即在酯酶作用下水解酯键生成二氯菊酸和α-氰基-3-苯氧基苄醇，后者自发转化为3-苯氧基苯甲醛，然后氧化生成毒性比母体农药更强的3-PBA。3-PBA在降解初期可被还原生成毒性相对较低的3-苯氧基苄醇，随着3-PBA的降解和转化，3-苯氧基苄醇又被氧化为3-PBA，这一现象可看作丝状真菌的自转保护机制。

　　图2总结了丝状线-PBA的两条途径。第一条途径是3-PBA先羟基化生成HO-3-PBA后再断裂醚键进行降解。随后生成的HO-3-PBA在加氧酶的作用下继续断裂醚键生成苯酚、2,5-二羟基苯甲酸或对苯二酚、3-羟基苯甲酸等产物，然后进入下一步代谢生成水和二氧化碳。第二条途径与部分细菌降解3-PBA途径类似，即在苯氧基苯甲酸双加氧酶的作用下直接断裂醚键生成原儿茶酸和苯酚。此外，李金永等还分析了产黄青霉（Penicillium chrysogenum）QH、米曲霉（Aspergillus oryzae）MAY、高大毛霉（Mucor mucedo）MHC、黑根霉（Rhizopus nigricans）GH降解3-PBA的代谢产物，发现4 种霉菌降解3-PBA产生的新物质存在差异，说明不同种类霉菌降解3-PBA途径存在一定的差异，还有待进一步研究。

　　目前丝状线-PBA的代谢产物鉴定方法主要是利用HPLC、GC-MS、LC-MS，但这些方法对于复杂基质中的化合物难以进行准确定性，高分辨质谱（HRMS）技术具有选择性强、良好的质量精度、高分辨率、高采集速率及高灵敏度等优点，这为鉴定PYRs和3-PBA的代谢产物提供了一种新的方法。此外，还可结合核磁共振技术、傅里叶变换红外光谱技术，全方位、多视角对未知代谢产物进行结构分析鉴定。

　　微生物对PYRs的降解主要是通过产生的酶来降解，这一过程涉及水解酶和氧化还原酶，水解酶主要有酯酶、脂酶、肽酶等，氧化还原酶主要有加氧酶、过氧化物酶等。目前对丝状真菌的PYRs降解酶的研究仅停留在酶的定位、降解性能以及纯化等方面。秦坤提取了高效降解氯氰菊酯镰刀菌（Fusarium sp.）TS-203的胞外和胞内酶液，利用HPLC测定氯氰菊酯降解率，结果发现在10 min内胞内酶对100 mg/L氯氰菊酯降解率为59.8%，胞外酶为10.3%，确定了镰刀菌氯氰菊酯降解酶主要是胞内酶。此外，对氯氰菊酯胞内酶降解特性进行研究，得出该酶最适pH值为7.0，最适温度为30℃，且有较好的热稳定性和pH稳定性。此外，该酶还可降解短中链脂肪酸的F-硝基苯酯。

　　大多数PYRs的降解酶属于水解酶家族的酯酶，在PYRs降解中起着关键的调节作。